摘要：研究銀耳多糖的提取分離與純化

關鍵詞：銀耳多糖；純化

銀耳多糖是從銀耳子實體或液體深層發酵的銀耳孢子中提取出來的一種活性多糖，從椴木銀耳中提取分離得到的酸性銀耳多糖具有廣泛的藥理活性,具有提高機體免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗潰瘍、抗血栓形成、等作用^[1]，能增強機體耐缺氧能力，清除自由基，能使人體產生抗體及干擾素。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料 椴木銀耳

1.2 試劑

2%的氫氧化鈉:10g氫氧化鈉加少量水溶解,定容至500mL,轉入試劑瓶保存備用;1%活性碳;稱取重蒸苯酚50g,定容至1000mg·mL- 1,配成5%的苯酚溶液,避光低溫保存待用;標準葡萄糖溶液(0.1mg·mL- 1):100mg標準葡萄糖定容至1000mL;硫酸,乙醇,丙酮,乙醚:均為AR級;DEAE-C52;Sevage試劑:氯仿-正丁醇溶液;0.5mol·L- 1鹽酸:41.5mL鹽酸加水稀釋到1000mL,試劑瓶保存備用;2mol·L- 1 NaCl溶液500mL。

1.3 儀器

雙重蒸餾水蒸餾器，超級恒溫水浴，旋轉蒸發儀RE52型，紫外可見分光光度計752N，低速大容量多管離心機LXJ-ⅡB型，透析袋，鋁鍋，攪拌器，天平，精密電子天平,電爐等。

2 實驗方法

2.1 銀耳多糖的提取

將20g銀耳子實體和800mL水加入1000mL燒杯中，于沸水浴中加熱攪拌8h，離心去殘渣(3000r/min,25min)。上清液用硅藻土助濾，水洗，合并濾液后于80℃水浴攪拌濃縮至糖漿狀。用2mol·L-1NaOH調至pH 7，加熱回流，用1%活性炭脫色,抽濾,濾液扎袋,流水透析48h。透析液離心(3000r·min-1,10min),上清液于80℃水浴濃縮至原體積的1/3。然后加入3倍量95%乙醇,攪拌均勻后,離心(3000r·min-1,15min),沉淀用無水乙醇洗滌2次,乙醚洗滌一次,真空干燥得銀耳多糖粗品。提取銀耳多糖的工藝流程(見圖1)。

2.2 銀耳粗多糖的純化

2.2.1 多糖液脫蛋白：

將粗多糖樣品溶于一定量的蒸餾水中，加入2/3體積的Sevage試劑(氯仿∶正丁醇= 5∶1，v/v)，然后將其置于分液漏斗中充分振搖10min，靜置分層。分液除去蛋白質沉淀后繼續加入Sevage試劑，重復3次。粗糖液蒸發濃縮，真空干燥得以進一步提純的粗多糖樣品，供季銨鹽法(CTAB)沉淀用。

2.2.2 季胺鹽沉淀法提純粗多糖：

0.5g銀耳粗多糖溶于50mL水中，溶解后離心(3000r·min- 1，10min)去除相應的沉淀,上清液加2%CTAB溶液至沉淀完全，搖勻，靜置4h,離心，沉淀用熱水洗滌3次，加100mL 2mol·L- 1 NaCl溶液于60℃解離4h,離心(3000r·min-1，10min),上清液流水透析12h。透析液于80℃水浴濃縮，加三倍量95%乙醇，攪拌均勻后，離心(3000r·min-1,10min)，沉淀再分別用無水乙醇、乙醚洗滌，真空干燥，得精品銀耳多糖，測定多糖含量。

2.3 多糖含量測定

硫酸苯酚比色法測定糖含量：其原理是，糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10mg～ 100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比，且在490nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。此比色法方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響,并且產生的顏色穩定160min以上。

2.3.1 制備標準曲線：取5支潔凈的糖管，按表1操作。

表1： 糖含量測定操作表

2.3.2 樣品糖含量測定：配制0.1mol·L的樣品液（粗品和精品），分別取1ml于試管中，其他操作同上。

3 實驗結果

3.1 銀耳多糖的產量與產率（見表2）

表2 銀耳多糖純化前后產量與產率

3.2 多糖含量測定的標準曲線（見圖2、表3）

圖二：標準曲線

表3：多糖含量測定實驗數據

3.3 樣品糖含量測定：樣品中粗品A=0.478，精品A=0.614.由回歸線方程A=1.1145C+0.0298得到粗品含糖0.495/0.1=50.5%；精品含量76.28%。

4 討論

本實驗采用的是季銨鹽（CTAB）沉淀法提取粗多糖，其原理為：

長鏈季胺鹽能與酸性多糖成鹽形成水不溶性化合物,可分離酸性及中性多糖。常用的季胺鹽是十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性,但其在高離子強度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物,卻不能沉淀核酸,所以我們在提取銀耳多糖后先用Sevage試劑[2]去除溶液中蛋白質,再通過加入CTAB沉淀銀耳多糖，最后加入乙醇沉淀即可使多糖分離出來。一般地說,酸性強或分子量大的酸性多糖首先沉淀出來。

季銨鹽沉淀法純化效果較好，既經濟又具有實用性，很適宜工業生產。在提取過程中可適當加熱，溫度不宜高過60℃，且需要不斷的攪拌以使提取能夠充分。經檢測，粗品經過CTAB法純化產率在37.4%，粗品中含糖50.5%。純化之后繼續檢測得到的產品，結果顯示產品含糖最高達76.28%。

文獻

[1] 聶偉,張永祥,周金黃.銀耳多糖的藥理學研究概況[J]，中藥藥理與臨床.2000,16(4):44- 46.

[2] evag MG:Biochen Z:273:419.1994.

[3] 和偉珍,吳麗仙.銀耳多糖的提取分離與純化[J]，海峽藥學.2008,20(7):33-35.